1943年，抗戰進入相持階段后期，日軍為挽救殘局，秘密展開了“芥子氣”化學武器的第三期研發，這就是歷史上臭名昭著的“丁號計劃”。日軍在我國東北地區隱蔽建立了大型的地下試驗基地。故事從上海開始……
1943年初秋，上海郊外，一輛裝著日軍“丁號計劃”的關鍵物資A1物資的運輸車正在行駛，突然殺出一伙蒙面人將物資車上的日軍殺死，并截獲了物資，當他們發現車上居然只一個箱子時就開始疑心日本人在搞鬼，此時又有大批日軍趕到開槍對著他們掃射，蒙面人抬著箱子急速撤離。
上島將軍得知A1號物資車被劫，且劫匪下落不明，頓時震怒。他對平田君說想不到上海的反動勢力那么猖狂，看來精心操練的反策隊該亮相了，正好捅一捅他們的馬蜂窩，第一目標就是搗毀他們的水鄉據點和那個來路不明的歌舞廳。他對平田君保證三天內一定找回丟失的物資。
此時民間抗日團隊“鐵血東北虎”成員們對著劫來的箱子犯了愁，心里既好奇里面到底裝的是什么？又怕狡猾的日本人會設下陷阱，不敢輕易打開。二把手羅長虎第一個沉不住氣，一把掀開箱蓋，眾人見并沒發生什么，紛紛圍了上去準備一瞧究竟，只見箱子里僅裝了幾個玻璃器皿和一些結晶體，正在他們討論不休時，日軍到了他們所在的村莊圍剿，大哥下令兄弟們將箱子里的東西分別保管，分頭逃走。
上海的百樂門舞廳，眾男子為了博得當紅交際花藍欣兒的青睞，使出了渾身的解數。
羅長虎深夜回家，在鬼子反策隊瘋狂掃蕩中受傷的張岸良在家門口等著他呢，他問羅長虎A1物資不是他們搶劫的吧？羅長虎矢口否認。
在上海灘一處神秘的教堂，“交際花”藍欣兒秘密與神父見面，神父讓她看了一張照片，問她是否認識此人，藍欣兒說日本大名鼎鼎的化學專家平田洋一，如今是世界炙手可熱的人物之一，怎么會不認識？神父甚至知道藍欣和平田洋一并不是簡單的認識，而是在德國留學期間的戀人。神父卡列安準備雇傭藍欣兒策反平田，藍欣兒似乎是為了錢爽快地答應了下來。
大島將軍為了保證“丁號計劃”研究組長平田洋一的安全，故意在各大報刊上放出“平田即將從碼頭離開上海”的消息，私下卻安排平田的弟弟平田洋二屆時出現在碼頭，試圖將上海灘的各方潛伏勢力一網打盡。平田卻提出兩個條件，一就是要保證他的安全，二要說服中國專家張岸仁加入“丁號計劃”，否則他哪兒也不去。
地下黨張岸良一直在羅長虎家里養傷，羅長虎一心希望加入組織，這天張岸良帶他去見趙隊長。趙隊長請羅長虎出手在碼頭上刺殺平田洋一。這一天上海灘碼頭人潮涌動，殺機四伏，上海灘的各方勢力齊聚，等著刺殺平田。終于平田現身，羅長虎準備出手，但被東北虎老大攔阻，此時各方勢力已紛紛動手，埋伏已久的日軍在大島指揮下兇悍地殺出，碼頭上頓時槍林彈雨，各方地下組織人員死傷慘重。羅長虎擺脫老大的糾纏出手刺殺平田，就在即將得手之際，卻遭到了神秘女子藍欣兒的開槍阻攔。羅長虎追上藍欣兒的車問她為什么護著日本人，但藍欣兒卻佯裝與他素未謀面的樣子。
因為暗殺被藍欣兒阻攔而失敗，羅長虎對藍欣兒的身份產生了懷疑，他一路跟蹤藍欣兒來到百樂門，這里正在舉行化妝舞會，羅長虎鬼鬼崇崇的樣子早被藍欣兒發現了，她在一杯酒里下了藥，讓侍應拿給他喝。正當羅長虎喝了酒暈暈乎乎地站在當地，日本來查良民證了，關鍵時刻藍欣兒還是機智地替羅長虎解了圍。
大島召集部下開會，說碼頭暗殺中逃脫的兩人的身手與搶劫A1物資的劫匪十分相似，是他們一直在通緝的共黨分子，他說他們身手了得，吩咐憲兵隊抓捕時一定要小心謹慎，確保萬無一失。
藍欣兒把羅長虎帶到玫瑰飯店安置，一路上迷迷糊糊的羅長虎大罵藍欣兒是女漢J、女特務。
“鐵血東北虎”的老大在一個勁地埋怨趙隊長，明明是日本人設的陷阱還一個勁地往里跳，害得他家老二到現在也下落不明。
張岸良重新找到羅長虎，告訴他碼頭上現身的平田是假的。藍欣兒再次來到教堂和神父見面，她對神父說自己成功在碼頭救了平田是不是應該加一筆錢呀？神父問她難道沒有看出來那個平田是假的嗎？藍欣兒篤定地說這世上只有兩個女人對平田最熟悉，一個是平田的母親，還有一個就是她，之所以留著假平田，那是因為留著一個替身，真的那個就沒那么容易被殺了。
張岸良發現羅長虎家魚缸里的魚全死了，一問之下才知道是羅長虎把日軍物資箱里的結晶石放在了魚缸里，看來這批物資有問題，老大突然想起米缸里也放了石頭。張岸良決定帶著羅長虎一起去找他哥哥張岸仁。
張岸良帶著羅長虎找遍了上海的水泥廠，他告訴羅長虎說他哥哥是一位化學天才，但因為總有人找他研究化學武器，所以他寧可躲在水泥廠里做苦力。他們剛發現了張岸仁的蹤跡，就被大島捷足先登，帶走了張岸仁。羅長虎和張岸良一路尾隨日本人來到劍道館，平田與張岸仁是留學德國時的同學，他對張岸仁非常親切，希望說服張岸仁加入他們的“丁號計劃”。但張岸仁始終一言不發，大島見他一個中國人如此傲慢非常惱火，但平田堅持認為目前找不到比張岸仁更好的合作者。
張岸仁不愿和日本人合作，他在室內自殺，張岸良心急如焚，不慎暴露了行蹤，張岸良和羅長虎于日本人混戰成一團，張岸良終因受傷被抓，羅長虎只身逃脫。大島火速將岸仁、岸良兄弟送醫院救治。平田再次提出劍道館不安全，他說每次來上海都住國際飯店的，請大島尊重他的習慣。神父找來藍欣兒告訴她平田入住國際飯店的事，讓她盡快采取行動，藍欣兒直接就把平田的房間號報了出來，她說神父的人已經嚴重妨礙了她的計劃。她對神父說他們只需要好好想想怎么把平田安全送往蘇聯就行了。
藍欣兒想辦法入住了國際飯店平田樓下的房間，準備開始采取行動。地下黨也時刻在飯店外監視，看了那個樓層高度，趙隊長說只有羅長虎辦得到。此時的羅長虎正被大哥綁在柱子上沒法動彈呢。大島指派了一刀流、武川藏、崗本忍術團新任團長崗本雄太三大高手貼身保護平田。
大島站在窗口望著園內的風景，說是果然符合平田川的風流本色，平田淡定地說自己潛心研究，至今未婚，連女朋友也沒有，又何來的風流本色？大島說平田君的五年前留學德國時認識了一個上海籍女子名叫瑪利亞，并與之交好，后來不知為何又分手了，平田君從德國追到了上海，這不是風流成性是什么？大島吩咐手下調查瑪利亞其人。
大島的話勾起了平田對往事的回憶，他拉開抽屜拿起放在里面的蘇繡手絹。德國盟軍發來電報說是查不到任何關于這個叫瑪利亞的中國女人的資料，大島說唯一的可能就是她在德國時的資料已經被銷毀。而這種情況只能出現在國際間諜身上。
羅長虎被老大囚禁著心急如焚，他說服兄弟老八給他松綁，直奔國際飯店，繼續執行刺殺平田的任務。
藍欣兒查到平田被軟禁在房間，她要求蘇聯修女卡琳娜在十二點十五分準時將平田點的餐送到她房間。羅長虎和八弟扮成日本軍人的樣子和趙隊長碰頭，趙隊長見來了后援十分欣慰。
藍欣兒打扮成侍應生的樣子推著餐車前往平田房間，此時羅長虎他們也進了飯店，被日本人盤問，他們說自己是上海駐軍警衛團的人，來找上島匯報，沒想到警衛團和他們反策隊一直是面和心不和，怎么可能有事情匯報？藍欣兒在小餛飩里下了藥，并將特意讓卡琳娜買來的蘇繡手帕塞在酒杯里，餐點被送了進去。在走廊里藍欣兒看到日本兵如臨大敵般的樣子，她總覺得有事要發生，匆匆回房她讓卡琳娜快離開，原本對她不屑一顧的卡琳娜開始慢慢信任她。
看著酒杯里的手帕，平田的思緒被拉回了兩人分手的那天，藍欣兒堅持要回國做交際花，平田不能理解藍欣兒的決定，臨分手時她就是給了自己這么一塊手帕留作紀念的。藍欣兒一直在樓下用聽診器關注著樓上的一舉一動，她聽到平田和守門的士兵發生了沖突，他要出門，藍欣兒高興地自語“成功了！”這時，羅長虎突然潛入平田房間，出手刺殺平田，大島發現危機，及時救援了平田，但自己被刺致重傷。藍欣兒的計劃被羅長虎的突然出現完全打亂了，這羅長虎身手了得，將日本人打得一個落花流水，平田趁機打暈大島希望逃出國際飯店。老八憑著自己的機靈勁也逃了出來，卻渾然不覺自己已被日本人跟蹤，將為兄弟們帶去滅頂之災。
羅長虎陰差陽錯地進了藍欣兒的房間，藍欣兒要與他做個交易，他放過平田，而她則可保他脫身。此時日本人進來搜查，藍欣兒用王老板作擋箭牌，順利逃過一劫。藍欣兒讓羅長虎穿上王老板的西裝，兩人挽手出門，一出門就遭到了日本人的圍追堵截，經過激烈的對決，羅長虎干掉了日本高手武川君，此時卡琳娜冒險救了他們。
藍欣兒責怪羅長虎打亂了她的計劃，導致策反平田的任務失敗，要羅長虎馬上離開，但羅長虎卻認定平田的失蹤和藍欣兒有關，讓藍欣兒說出平田的去處。